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血管生成實驗步驟-實驗方法完善版

更新時間:2016-03-29   更新時間:2016-03-29   點擊次數(shù):4989次

前言

      無論原發(fā)性腫瘤還是繼發(fā)性腫瘤,一旦生長直徑超過1~2 mm,都會有血管生成。這是由于腫瘤細(xì)胞自身可分泌多種生長因子,誘導(dǎo)血管生成。多數(shù)惡性腫瘤的血管生成密集且生長迅速。因此,血管生成在腫瘤的發(fā)展轉(zhuǎn)移過程中起到重要作用,抑制這一過程將能明顯阻止腫瘤組織的發(fā)展和擴(kuò)散轉(zhuǎn)移。于是體外的血管生成實驗就能很好的模擬腫瘤的血管發(fā)生過程,并且適合研究藥物對這一過程的影響實驗。本實驗HUVEC細(xì)胞為例,介紹這一實驗的詳細(xì)過程。

圖一  血管生成鏡檢圖

 

一.實驗材料和實驗方法

1.實驗材料

2.實驗方法:
2.1實驗流程介紹

圖二  實驗流程圖

提前將Matrigel融化,鋪于ibidi血管生成載玻片的下孔中,待膠凝后,將細(xì)胞懸液加入血管生成載玻片上孔中,成管后使用顯微鏡觀察。

 

2.2耗材結(jié)構(gòu)介紹

圖三   血管生成載玻片縱截面示意圖

(Matrigel鋪在下孔,細(xì)胞鋪在Matrigel上,上孔充滿培養(yǎng)基)


2.3數(shù)據(jù)分析流程介紹

圖四  實驗結(jié)果收集和分析流程圖

在特定的時間點采集圖片,并且進(jìn)行圖像分析(Wimasis全自動分析)測量小管長度,成環(huán)數(shù),細(xì)胞覆蓋面積和結(jié)點。之后在對測量結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計分析以說明實驗結(jié)果。

 

二、實驗步驟

1、準(zhǔn)備基質(zhì)膠

  1. 實驗前一天將Matrigel置于冰盒中,放入4C冰箱,使膠能緩慢融化。(注意:同樣要準(zhǔn)備一些4。C預(yù)冷的槍頭用于吸取Matrigel

2.開始實驗前,將Matrigel始終保持放在冰盒中。

3.打開滅菌包裝,取出ibidi血管生成載玻片。

4.每孔中加入10μl Matrigel。注意槍頭要垂直于內(nèi)孔的正上方加入Matrigel,防止有Matrigel流經(jīng)上孔而留下殘留膠。

由于Matrigel流動性不強,并且有可能移液槍不準(zhǔn)確,有可能打入10μl的膠,卻不能填滿血管生成載玻片的下孔——這樣,必然會影響到實驗的成像結(jié)果。

 

如何判斷是否加入了合適體積的Matrigel

我們只需用一張格子紙就能知道自己的移液槍調(diào)整到多少能正好把下孔填滿。

如上圖所示,垂直透過每個孔看下面的格子紙,如果格子被縮小了,那么就說明膠沒加滿,格子被放大了,那么膠就加多了,格子沒發(fā)生什么變形,這才是剛剛加滿下孔的狀態(tài)。

 

3、凝膠

  1. 蓋上ibidi血管生成載玻片的蓋子。
  2. 準(zhǔn)備一個10cm的培養(yǎng)皿,放入浸過水的紙巾,制成一個濕盒。
  3. ibidi血管生成載玻片放入培養(yǎng)皿中,蓋上培養(yǎng)皿蓋。
  4. 將整個培養(yǎng)皿放入培養(yǎng)箱中,靜置30分鐘左右,等待膠凝結(jié)。
  5. 等待同時準(zhǔn)備細(xì)胞懸液。

 

3、鋪細(xì)胞

加入細(xì)胞的量直接影響實驗結(jié)果,所以在正式實驗開始之前,要對不同類型的細(xì)胞和使用數(shù)量進(jìn)行預(yù)實驗。獲得佳比例的細(xì)胞密度。我們今天的實驗使用HUVEC細(xì)胞,每孔種10000個細(xì)胞即可。

  1. 準(zhǔn)備密度為2*105cells/ml的細(xì)胞懸液,充分混勻。
  2. 將膠已經(jīng)凝固的ibidi血管生成載玻片從濕盒中取出。
  3. 每孔加入50μl的細(xì)胞懸液,注意保持槍頭垂直在上孔的上方,不要接觸下孔的凝膠??梢允褂门艠尅?/span>
  4. 同樣用格子紙查看是不是加了足夠量的液體,如果沒有,加入無細(xì)胞的培養(yǎng)基,使上孔液體正好加滿。
  5. 蓋上蓋,靜置,一段時間后,所有細(xì)胞都會沉下去落在Matrigel的表面。

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?4、采集圖像并統(tǒng)計結(jié)果
可以按照細(xì)胞的生長速度定時采集圖像,并且對其成管長度,覆蓋面積,成環(huán)數(shù),結(jié)點數(shù)進(jìn)行測量和記錄,并且對其進(jìn)行統(tǒng)計分析。

5、免疫熒光染色
根據(jù)需要,可以對成管結(jié)果進(jìn)行免疫熒光染色。
小心的移除上孔內(nèi)培養(yǎng)基,注意不要碰到膠或者細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)。
加入50μl用無血清培養(yǎng)基稀釋的calcein (12.5 µl calcein stock 1 µg/µl),使其終濃度為 6.25 µg/ml (1:160)。
在室溫下避光孵育30分鐘。
使用PBS清洗三次,注意,PBS要緩緩加入上孔,以免沖擊掉細(xì)胞。
使用 485 nm/ 529 nm進(jìn)行免疫熒光成像。

實驗優(yōu)勢

1.這個實驗方法能節(jié)省更多基質(zhì)膠,降低實驗成本;

2.分上下孔的ibidi血管生成載玻片能去除凹液面,使成像效果更好。

圖五  成像對比

(左側(cè)ibidi血管生成載玻片無凹液面,整個視野成像清晰;右側(cè)96孔板有凹液面,中間清晰周圍模糊。)

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