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ibidi腔室載玻片|揭示鈣成像細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的奧妙!

更新時(shí)間:2023-06-29   更新時(shí)間:2023-06-29   點(diǎn)擊次數(shù):1060次

  細(xì)胞內(nèi)的鈣稱為細(xì)胞內(nèi)鈣,可受到高度調(diào)節(jié);這種緊密的調(diào)節(jié)使細(xì)胞內(nèi)鈣成為了解細(xì)胞功能和信號動力學(xué)的較佳的工具,使其能夠在細(xì)胞遷移、交流和對刺激物或異物作出反應(yīng)的能力。

  

  鈣:細(xì)胞過程的多功能指示劑

   

  鈣信號可作為讀數(shù)來了解病毒在感染過程中利用宿主信號反應(yīng)的能力,并剖析所涉及的信號通路。有幾種細(xì)胞內(nèi)鈣的熒光指示劑是可用于研究細(xì)胞功能;能夠檢查傷口愈合、傳染病、藥物治療等過程中的細(xì)胞反應(yīng)。為此可利用含有熒光鈣指示劑的細(xì)胞的活細(xì)胞成像,其中熒光的增加表明細(xì)胞內(nèi)鈣的增加。

  

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  鈣指示劑的種類及其應(yīng)用

  

  鈣指示劑主要分為兩大類:化學(xué)指示劑和基因編碼的鈣指示劑??捎糜诨罴?xì)胞成像實(shí)驗(yàn)的鈣指示劑類型取決于預(yù)期的細(xì)胞系、成像長度以及定性或定量數(shù)據(jù)的預(yù)期結(jié)果等因素。

  

  1.預(yù)期細(xì)胞系:

  

  對于原代細(xì)胞系直接的方法是使用熒光染料,將熒光鈣指示劑簡單地添加到培養(yǎng)的細(xì)胞中,并在孵育期后成像。


  與基因編碼的鈣指示劑相比,熒光染料通常更亮、更穩(wěn)定。在活細(xì)胞成像中,熒光染料可以有效地進(jìn)行短期活細(xì)胞成像,但隨著時(shí)間的推移細(xì)胞有排出染料的趨勢。鈣染料的一個重要考慮因素是使用抑制劑還是激動劑。抑制劑和激動劑也可能影響鈣染料反映,類似于在天然組織中的表達(dá)。

  

  在廣泛的鈣信號傳導(dǎo)實(shí)驗(yàn)中,已建立的細(xì)胞系是可以被轉(zhuǎn)導(dǎo)以表達(dá)遺傳編碼的鈣指示劑,如GCaMP、黃色cameleon等。對現(xiàn)有的不同基因編碼鈣指示劑進(jìn)行改進(jìn),使指示劑更亮,光穩(wěn)定性更好,動態(tài)范圍更大,從而提高了鈣的敏感性。慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)是細(xì)胞系中使用的一種較佳的工具,它將允許您選擇的指示劑在細(xì)胞系中穩(wěn)定表達(dá)?;蚓幋a報(bào)告系統(tǒng)的一個潛在問題是,并非所有細(xì)胞系都容易被轉(zhuǎn)導(dǎo)。  

  

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  在用ADP 進(jìn)行激動劑治療期間,人腸道類器官單層的實(shí)時(shí)、短期成像。這些有機(jī)體單層以綠色表達(dá)鈣指示劑 GCaMP6s。ADP 是一種已知的激動劑,用于在細(xì)胞中引發(fā)細(xì)胞內(nèi)鈣信號傳導(dǎo)。激動劑治療是測試治療劑量反應(yīng)的較的好方法。

  

  2.成像長度

  

  對于活細(xì)胞成像,時(shí)間長度和間隔是需要記住的重要參數(shù)。細(xì)胞成像過程中的主要關(guān)注的是光漂白和光毒性。應(yīng)避免持續(xù)使用激發(fā)光,重要的是選擇足夠強(qiáng)的曝光時(shí)間和光功率,以檢測鈣信號,但不要過強(qiáng),以免對細(xì)胞造成損害。成像的長度將取決于實(shí)驗(yàn)。對于測試激動劑或細(xì)胞反應(yīng),這通常是5-20分鐘的較短成像運(yùn)行,每1-2秒捕獲一次圖像。對于研究傷口修復(fù)或病毒感染期間鈣信號傳導(dǎo)的實(shí)驗(yàn),我們會在18-20小時(shí)內(nèi)成像,每分鐘捕捉一次圖像?! ?/span>

  

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  活細(xì)胞成像的技巧

  

  考慮要使用的細(xì)胞系是很重要的。為了研究鈣動力學(xué),使用形成單層的細(xì)胞系將確保感興趣的區(qū)域保持聚焦,以捕捉信號動力學(xué),從而獲得較佳質(zhì)量的視頻和清晰的量化。對于涉及細(xì)胞間通訊和鈣動力學(xué)的實(shí)驗(yàn),細(xì)胞系融合也是一個重要的考慮因素。為了獲得質(zhì)量的圖像,選擇合適的載玻片非常重要。有些細(xì)胞培養(yǎng)物更喜歡玻璃載玻片而不是光學(xué)級塑料載玻片,因此最好測試腔室載玻片。我們的細(xì)胞系使用ibiTreat μ-Slide 8 Well high八孔高壁腔室載玻片。  

  

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μ-Slide 8 Well high(貨號: 80806)

  

  活細(xì)胞成像是使細(xì)胞的密度允許形成一個融合的單層,但不會導(dǎo)致細(xì)胞過度擁擠和團(tuán)塊。在成像過程中需要使用合適的培養(yǎng)基。許多傳統(tǒng)的細(xì)胞培養(yǎng)基含有酚紅,它可引起高背景熒光。這使得在成像過程中很難從背景噪聲中分離出真實(shí)信號。因此,重要的是用PBS洗滌細(xì)胞,并用無酚紅培養(yǎng)基或市售的用于活細(xì)胞成像的培養(yǎng)基代替培養(yǎng)基。  

  

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