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ibidi24孔預(yù)置插件培養(yǎng)板|高通量細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)解決方案

更新時(shí)間:2022-09-09   更新時(shí)間:2022-09-09   點(diǎn)擊次數(shù):1226次

  此次實(shí)驗(yàn)便是應(yīng)用了ibidi Culture-Insert 2 Well 在24孔培養(yǎng)板上分析MCF-7細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)的詳細(xì)方案,為傷口愈合實(shí)驗(yàn)提供了完整的解決方案,并進(jìn)行測(cè)試了五種不同濃度的人表皮生長(zhǎng)因子(hEGF)對(duì)遷移行為的影響并與對(duì)照條件進(jìn)行比較。

  

  實(shí)驗(yàn)工作流程:

  

  3.1 步驟1:細(xì)胞接種  

  正確的接種濃度是一個(gè)關(guān)鍵參數(shù),因?yàn)?4小時(shí)后應(yīng)達(dá)到匯合的單層。需要進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)以確定所用細(xì)胞系的最佳濃度。

  1. 取下附在μ-Plate底部的保護(hù)膜?!?/p>

  2. 像往常一樣準(zhǔn)備細(xì)胞懸液。建議包括離心步驟以去除死細(xì)胞和細(xì)胞碎片。將MCF-7細(xì)胞懸浮液調(diào)節(jié)至細(xì)胞濃度為5×105細(xì)胞/ml?! ?/p>

  3. 將70μl細(xì)胞懸浮液應(yīng)用于2孔的培養(yǎng)插件每個(gè)孔中。避免搖動(dòng)μ-Plate,因?yàn)檫@會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞分布不均勻。  

  4. 將細(xì)胞在37°C和5%CO2培養(yǎng)至少24小時(shí)。  

  

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  圖2在開(kāi)始細(xì)胞接種步驟(A)之前取下保護(hù)膜。將70μl細(xì)胞懸浮液填充到2孔培養(yǎng)插件(B)的每個(gè)孔中。

  

  3.1 步驟2:劃痕形成

  μ-Plate 24 Well的使用并行測(cè)試五種不同的hEGF濃度和對(duì)照條件。每種實(shí)驗(yàn)條件可以進(jìn)行四次技術(shù)重復(fù). 

  1. 在顯微鏡下觀察培養(yǎng)24小時(shí)后的細(xì)胞密度。如果24小時(shí)后未達(dá)到融合細(xì)胞單層,則將μ-Plate于細(xì)胞培養(yǎng)箱中再培養(yǎng)幾個(gè)小時(shí)。定期檢查匯合點(diǎn)?! ?/p>

  2. 將生長(zhǎng)因子添加到細(xì)胞培養(yǎng)基中以獲得以下濃度:0,5,10,20,30和40ng / ml EGF?! ?/p>

  3. 用無(wú)菌鑷子輕輕取出2孔培養(yǎng)插件。要移除培養(yǎng)插件,請(qǐng)抓住一個(gè)角,如圖3所示。  

  4. 用無(wú)細(xì)胞培養(yǎng)基或PBS洗滌細(xì)胞層以除去細(xì)胞碎片和未附著的細(xì)胞?! ?/p>

  5. 小心吸出無(wú)細(xì)胞培養(yǎng)基或PBS。 

  6.用移液管將1ml細(xì)胞培養(yǎng)基加到24孔板的每個(gè)孔中。

  

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  圖3使用無(wú)菌鑷子取出2孔培養(yǎng)插件

  

  3.1 步驟3:獲取顯微鏡圖像  

  我們建議錄制延時(shí)視頻,以確定時(shí)間依賴性和細(xì)胞遷移的特征?! ?/p>

  1. 將μ-Plate 24孔培養(yǎng)板放在顯微鏡上并確定所有24個(gè)孔的位置?! ?/p>

  2. 在接下來(lái)的幾個(gè)小時(shí)內(nèi)多次拍攝圖像,開(kāi)始觀察過(guò)程。在24小時(shí)內(nèi)每30分鐘拍攝一次圖像?! ?/p>


  4.結(jié)果 

  分析顯微圖像以獲得關(guān)于培養(yǎng)細(xì)胞遷移特征信息。分析細(xì)胞覆蓋區(qū)域隨時(shí)間的變化來(lái)確定細(xì)胞速度。

  

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  圖4 hEGF對(duì)MCF-7細(xì)胞遷移行為影響的比較。測(cè)試了四種不同的EGF濃度,并與對(duì)照實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了比較。

  

  使用Culture-Insert 2 Well 在24孔培養(yǎng)板上進(jìn)行測(cè)試六種不同(或更多)的條件。通過(guò)比較細(xì)胞速度與對(duì)照條件的速度來(lái)分析五種不同hEGF濃度(每種重復(fù)四次)的影響。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示,與對(duì)照組相比,hEGF增加了MCF-7細(xì)胞的細(xì)胞速度。如圖4所示,hEGF> 10ng / ml的濃度顯示細(xì)胞速度沒(méi)有進(jìn)一步增加。

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