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免疫熒光應(yīng)用|巨噬細(xì)胞在ibidi腔室載玻片通道載玻片中的培養(yǎng)處理

更新時(shí)間:2022-09-02   更新時(shí)間:2022-09-02   點(diǎn)擊次數(shù):1241次

  小鼠巨噬細(xì)胞系RAW-264.7(生物安全等級2)在ibidi µ-Slides VI 0.4 和8孔腔室載玻片的培養(yǎng)方案。這是一個(gè)特殊的細(xì)胞系的例子,用于顯示粘附時(shí)間,細(xì)胞密度和細(xì)胞形態(tài)的示范。本應(yīng)用可根據(jù)您的具體實(shí)驗(yàn)要求進(jìn)行調(diào)整。


  1.細(xì)胞培養(yǎng)與材料制備  

  在將細(xì)胞接種到玻片中之前,按照常規(guī)的方法培養(yǎng)細(xì)胞?! ?/p>

  µ-Slide VI 0.4 :通道玻片和培養(yǎng)基,在37℃和5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。這對于避免隨著時(shí)間的推移出現(xiàn)氣泡至關(guān)重要。為此,在50 ml器中填充適量的培養(yǎng)基,并輕輕地將瓶蓋擰緊。在 µ-Slide 8孔載玻片開放孔井中,氣泡可排出到大氣中?! ?/p>

  拆開µ-Slide的包裝,把它放在µ-Slide支架上,并在準(zhǔn)備細(xì)胞懸浮液時(shí)同時(shí)將蓋子放在 Luer 適配器/孔上。


  2.播種細(xì)胞

  分離細(xì)胞:  

  吸出培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基,并用PBS洗滌細(xì)胞一次。每75cm2 燒瓶中加入3-5 ml的Accutase,并將燒瓶放入培養(yǎng)箱中以加快分離速度。如果是RAW-264.7細(xì)胞系,則大約需要8分鐘。使用Accutase分離的細(xì)胞存活率更高?! ?/p>

  

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  2.1. 將細(xì)胞接種到µ-Slide VI 0.4中  

  在µ-Slide VI 0.4建議的細(xì)胞濃度:最終細(xì)胞數(shù)  0.3 x 10 5 cells/cm2,制備濃度6 x 10 5cells/ml。通過將移液器底部直接放在通道的入口上,將30 µl細(xì)胞懸浮液填充到每個(gè)通道中。將蓋子蓋在玻片上,在37°C和5%CO2下孵育半小時(shí)以固定細(xì)胞。 

  細(xì)胞貼壁后,分別用60 µl無細(xì)胞培養(yǎng)基填充儲液池。 避免將移液器吸頭直接指向通道的入口。將玻片放回培養(yǎng)箱中?! ?/p>

  

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  圖1:接種后一小時(shí),在ibiTreat µ-Slide VI 0.4(貨號80606)中的RAW-264.7  

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  圖2: 在ibiTreat µ-Slide VI 0.4中的RAW-264.7,孵育24小時(shí)后  

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  圖3:在ibiTreat µ-Slide VI0.4中的RAW-264.7,培養(yǎng)四天后

  

  2.2 將細(xì)胞播種在µ-Slide 8 well 中  

  

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  在µ-Slide 8 well建議的細(xì)胞濃度:最終細(xì)胞數(shù) 0.3 x 10 5 cells/cm2 ,制備濃度 1.1 x 10 5 cells/ml。將300 µl 的細(xì)胞懸浮液注入各孔中。將蓋子蓋在玻片上,在37°C和5% CO2中孵育。不需要進(jìn)一步添加培養(yǎng)基。

  

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  圖4:在ibiTreat µ-Slide 8 well(貨號:80826)中的RAW-264.7,播種后1小時(shí)  

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  圖5: 在ibiTreat µ-Slide 8 well中的RAW-264.7,孵育24小時(shí)后

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  圖6:在ibiTreat µ-Slide 8 well中的RAW-264.7,經(jīng)過四天的培養(yǎng)

  

  為獲得最佳的分布的勻的細(xì)胞,我們建議使用像µ-Slide VI 0.4 這樣的通道載玻片。在8孔腔室載玻片中,細(xì)胞密度可能會在孔的整個(gè)表面上因點(diǎn)而異,具體取決于細(xì)胞播種過程中的處理。

  

  3. 免疫熒光染色  

  像往常一樣為您的細(xì)胞固定和染色?! ?/p>

  注意:在 µ-Slides 中染色時(shí)注意液體的處理  

  µ-Slide VI 0.4 :更換液體,先吸出兩個(gè)儲液池而不排空通道。 如果您使用的是真空設(shè)備,請注意不要將吸頭直接放在通道的入口上。 用100 µl新溶液沖洗通道3次。 從一側(cè)添加新的溶液,通過通道流入另一個(gè)儲液池,然后從另一側(cè)吸出,直到兩個(gè)儲液池都排空。注意通道永遠(yuǎn)不要干涸!  

  µ-Slide 8孔載玻片:在 µ-Slide 8孔中,無需特殊處理措施。像在任何其他培養(yǎng)皿或孔板中一樣的交換液體。

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